滑膜间充质干细胞与软骨细胞移植修复膝关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.018

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1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2015年11月至2016年6月在新疆医科大学第一附属医院科技动物研究中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：取健康SPF级雄性12至13周SD大鼠76只，体质量175-225 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2003-001，其中1只大鼠用于体内实验细胞的制备，另外75只大鼠用于体外实验建立动物模型。

1.4 实验方法

1.4.1 体外实验

大鼠膝关节滑膜间的充质干细胞分离和培养^[9]：将大鼠腹腔注射体积分10%水合氯醛300 mg/kg麻醉成功后，使用体积分数75%乙醇严格消毒术区，于SD大鼠健康膝关节活动处做纵行向手术切口，并根据大鼠膝关节解剖结构以此分离直至滑膜组织处，取膝关节关节囊外韧带包裹的滑膜组织，置于含1 000 U/mL青霉素和链霉素的双抗PBS中，所得组织4 ℃保存，紫外灯照射10 min，移入超净台，PBS连续冲洗3遍，将滑膜组织剪成0.5 mm×0.5 mm的组织块，放入10倍体积分数0.4%Ⅰ型胶原酶，使用摇床(37 ℃，200 r/min)并进行消化3.5 h，过滤细胞并进行收集，加入PBS连续清洗2遍离心，使用H-DMEM培养基(含200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)悬浮细胞，按2.5×10⁵/cm²的浓度接种于培养基中，培养48 h后换液，建立出进行原代培养细胞，每隔2 d换液1次。待细胞浓度达到80%-85%融合时，细胞进行消化，计数后按(6-8)×10³/cm²的浓度接种于含有体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM培养基，所取细胞传代培养，进行后期实验。

大鼠膝关节软骨细胞的分离与培养：大鼠腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，再次分别取SD大鼠股骨头处及膝关节的软骨组织，分别放置于青霉素的双抗PBS和1 000 U/mL链霉素中，4 ℃保存，所取组织用紫外灯照射10 min，快速移入超净台，PBS连续冲洗3遍；加入体积分数0.25%胰酶1 mL，放入摇床中(37 ℃，200 r/min)消化30 min；PBS连续冲洗2遍，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶并放入摇床中(37 ℃，200 r/min)消化12 h；取上层液体200目滤网过滤，将收集的液体离心后，用体积分数15% H-DMEM培养基的胎牛血清悬浮细胞，按2×10⁵/cm²的浓度接种于培养基中，培养48 h后换液，建立培养原代细胞，每隔48 h换液1次。待细胞生长达到80%-95%融合时，进行细胞消化，计数后按(6-8)×10³/cm的浓度接种于含有H-DMEM培养基进行传代培养，保存并进行后期实验使用。

软骨细胞和滑膜间充质干细胞联合传代培养^[10]：软骨细胞与滑膜间充质干细胞传代培养方法基本相同。观测原代细胞达到75%-85%融合时，取培养皿中生长液，移置于离心管，使用2 000 r/min离心5 min用来生成终止液，PBS连续洗皿两三遍，并加入0.25%胰蛋白酶消化所取的细胞，镜下观察细胞变外形变至圆形时，立刻使用终止液终止细胞消化，收集细胞至无菌离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃上层清液，并加入PBS清洗黏附在细胞上存在的胰蛋白酶，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，使用H-DMEM培养基悬浮细胞，计数后按(6-8)×10³/cm²的浓度接种于H-DMEM培养基中，用于后续实验。

壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料复合物常规制备及细胞复合培养：按以往研究方法进行壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料常规制备^[11]，将单纯滑膜间充质干细胞、单纯软骨细胞、滑膜间充质干细胞与软骨细胞1∶2比例共培养细胞分别与支架材料混合培养72 h。

扫描电镜观察支架材料组织的超微结构：支架材料复合物培养72 h后，将支架材料用PBS连续漂洗三四遍，使用4 ℃的体积分数5%戊二醛固定支架1 h后，弃固定液，PBS漂洗支架材料3次，使用叔丁醇对细胞支架复合物进行逐步脱水(体积分数70%，75%，80%，85%，90%，95%，100%)，每种浓度脱水5 min，干燥冷冻后喷金处理，置于扫描电镜中照相。

1.4.2 体内实验

建立软骨缺损大鼠模型：新取健康雄性十二三周SD大鼠75只，称质量，体积分数10%水合氯醛3.0-4.0 mL/kg腹腔注射麻醉成功后，大鼠仰卧在手术台上，四肢制动，术区备皮，手术常规消毒，铺无菌洞巾，沿着大鼠膝关节内侧切开皮肤及皮下组织并切开关节囊，向外推髌骨拖尾髌骨，线路膝关节股骨滑车，使用牙科慢速机钻制成一直径为1.5 mm，深度为2.5 mm大小的圆形膝关节软骨缺损模型。见图1。

分组及干预：将75只大鼠随机分为4组：单纯滑膜间充质干细胞组20只、单纯软骨细胞组20只、滑膜间充质干细胞与软骨细胞1∶2组20只、空白支架组15只，分别将相应的支架复合物植入模型大鼠的软骨缺损组织中。植入后密切观察术区变化及大鼠膝关节活动状况。植入后4，8，12周分别给予大鼠体积分数10%水合氯醛麻醉后脱颈处死，取材包埋大鼠股骨下端软骨缺损区域关节面。见图1。

标本制备及组织学观察：取材标本给予流动生理盐水缓慢冲洗10 min，体积分数4%中性甲醛叶固定6 h，取出固定标本流动水及生理盐水交替冲洗5 min。取PapidCal.Immuno^TM脱钙液(中杉金桥公司)体积10倍于组织块，对标本脱钙15 d。待脱钙完成后，体积分数75%乙醇隔夜。梯度乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋组织。沿着关节面切取含有植入物临近区域的软骨及骨组织，分别进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色，置于显微镜下观察。

免疫组织化学染色：组织标本脱蜡复水，PBS浸泡3 min，体积分数3%双氧水3 μL，室温静置20 min，PBS洗5 min×3，体积分数0.1%胰酶在37 ℃的细胞培养箱中(放入湿盒中)消化35 min，PBS洗5 min×3，山羊工作液血清封闭10 min，倒去血清，并用滤纸将周围的血清吸干，滴加一抗Ⅱ型胶原25 μL (1∶100)，放入湿盒后4 ℃过夜，次日从4 ℃冰箱取出湿盒，室温 1 h，PBS洗5 min×3，滴加二抗(博士德公司)，放入湿盒室温孵育1.5 h，PBS洗5 min× 3，滴加辣根过氧化物酶，放入湿盒室温孵育2 h，PBS洗5 min×3，DAB显色(博士德公司)10 min，放入自来水终止显色反应，自来水连续冲洗5 min×3，滴加HaiTi氏苏木精30 s，自来水清洗终止反应，放入50 ℃温水返蓝30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明10 min，中性树胶封固。置于显微镜下观察并采图。

1.5 主要观察指标 ①大鼠植入后切口愈合状况、是否有术区感染等现象，活动步态；②一般观察：植入体与周围组织的生长密和度、植入体与周围组织平整度、植入体与周围组织光滑度、及再生软骨色泽；③组织学观察：镜下观察支架材料中的细胞分布以及支架材料软骨细胞外基质、软骨标志物Ⅱ型胶原的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

组织工程技术及相应学科的快速发展，为临床中关节软骨的缺损的修复提供了更新的研究思路，实验取材的滑膜间充质细胞及软骨细胞可成为组织工程优势的种子细胞^[12-16]，其都具有较强的自我更新能力，通过体外实验研究下可见其具有多方向分化的潜能，然而培养自体软骨细胞，在软骨缺损修复中被证实可有较为可观的治疗效果，但是通常所获得软骨细胞数量很少，在体外扩增过程中往往表现过慢，并且极易分化，不便为缺损修复提供所需生长基础。而滑膜间充质干细胞其分化能力呈现多向分化，在各项诱导环境下可表现为软骨分化能力，既往研究表明滑膜间充质干细胞取材方便，有更加强的分化能力^[17-18]，这给予颞下颌骨关节病提供良好机遇。滑膜间充质干细胞可分化成为软骨细胞，其更加适应修复软骨缺损的能力^[19]。

滑膜间充质干细胞通常取自自体并且极易诱导分化，较少会发生免疫排斥反应^[20]，经植入后4，8，12周组织学研究发现：软骨缺损表面，在支架材料中滑膜间充质干细胞逐步转化成为软骨细胞，并且可见软骨缺损区域分泌软骨机制，在体内环境下呈现向新生软骨方向下发展。

通过组织工程支架材料的重点研究，将两种分化潜能较为理想的细胞分别混合培养于支架材料中，可见细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合物支架材料有较强的生物组织相容性。目前笔者所研究的壳聚糖/Ⅰ型胶原复合材料无细胞毒性，其孔径均匀，可大批量用于实验生产，已被业界所肯定。实验结果显示，缺损植入后4周可见细胞多数分布于支架材料的边缘。植入后8周，可见细胞多呈现向支架材料中央处生长，植入后12周，修复组织出现表面光滑，修复缺损区域组织与正常软骨组织在肉眼观下已经难以区分。镜下可见修复缺损区域的组织与正常组织边界处融合良好，未见明显裂隙、断裂脱离、粘连感染迹象；修复区域软骨组织生长的厚度与正常软骨较为相似，支架材料中细胞数量逐渐表现增多趋势，单纯滑膜间充质干细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞 1︰2 组的细胞和细胞机制分布于支架材料中，单纯软骨细胞在支架材料中分布较少，对比单纯滑膜间充质干细胞与滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组中，呈现较好的增值现象，大批量实验研究表明Ⅱ型胶原为软骨的分子标志物，免疫组织化学染色实验结果显示植入后4，8，12周壳聚糖复合物均可见阳性表达现象，在植入后12周时滑膜间充质干细胞︰软骨细胞 1︰2 组可见细胞周围基质及细胞胞浆表达出现强阳性。

大部分哺乳动物的软骨组织起源较为相同，所以，采用大鼠膝关节的软骨缺损制造的动物模型，来评价支架材料修复软骨缺损模型并观察其成软骨的能力较为理想，现研究阶段通过动物实验建立相关软骨缺损模型已十分成熟。

综上所述，以壳聚糖为载体的支架材料可为体内软骨缺损提供良好的生物内环境，滑膜间充质干细胞在其提供的稳定环境下继续呈软骨细胞分化，在机体应力的内环境作用下良好的塑性，并形成正常功能的软骨组织；新生软骨组织与周围正常组织随着时间推移，可良好的整合，这也为软骨缺损功能修复提供了优良基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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摘要

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文题释义：
细胞共培养：将 2 种不同的细胞共同培养，主要利用细胞之间相互接触，诱导一种细胞向另外一种细胞分化或诱导细胞自身分化，维持细胞功能和活力，对细胞增殖进行调控。
胶原蛋白类型：胶原蛋白有不同的类型，目前为止已经发现了几十种。其中Ⅰ，Ⅲ型主要存在于皮肤血管等结缔组织中；Ⅱ型主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织；Ⅶ型主要存在于子宫胎盘中。

摘要
背景：膝关节软骨损伤后修复较困难。有研究发现将关节软骨细胞和滑膜间充质干细胞混合培养接种于壳聚糖支架材料中，均可以形成软骨基质。
目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料对膝关节软骨缺损的修复情况。
方法：将大鼠膝关节滑膜间充质干细胞及软骨细胞按1∶2比例共培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中，将此复合材料移植于膝关节软骨缺损模型大鼠膝关节缺损处进行修复。
结果与结论：①组织学变化：苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及番红O染色显示，植入后4，8，12周，大鼠膝关节软骨细胞逐渐增多；②软骨样组织标记物Ⅱ型胶原表达：免疫组织化学染色显示，移植后4，8，12周，大鼠膝关节软骨组织细胞及细胞基质可见Ⅱ型胶原阳性表达。③结果证实，滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中，在体内环境下能够形成软骨样组织，有利于损伤膝关节软骨缺损的修复。

ORCID: 0000-0003-2837-7275(胡鑫)

关键词 ：干细胞；移植；干细胞移植；软骨组织工程；滑膜间充质干细胞；软骨细胞；共培养技术； Ⅱ型胶原；蛋白聚糖；国家自然科学基金；

Abstract：

BACKGROUND: As is known to all, it is difficult to repair cartilage defect of the knee joint. Fortunately, it is reported that a chitosan scaffold with the mixture of synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes enables the formation of cartilage matrix.
OBJECTIVE: To observe the chondrogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on a chitosan/type I collagen composite scaffold after being transplanted into an animal model.
METHODS: The synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes harvested from the knee joint of Sprague-Dawley rats were co-cultured at a ratio of 1:2 on the chitosan/type I collagen composite scaffolds and transplanted into the defect site of the knee joint in rat models of cartilage defect of the knee joint.
RESULTS AND CONCLUSION: After 4, 8, 12 weeks, the hematoxylin-eosin staining, the toluidine blue staining of aggrecan, and safranine O staining showed that there were increasing chondrocytes in the rat knee joint. The immunohistochemical staining of type II collagen showed the positive expression of type II collagen in the cartilage tissues and extracellular matrix of the knee joint. To conclude, the combination of two kinds of cells cultured in the chitosan/type II collagen composite scaffold can form cartilage-like tissues in vivo, and improve the quality of cartilage repair.

Key words： Tissue Engineering; Chondrocytes; Synovial Membrane;

中图分类号:

R394.2

基金资助: 国家自然科学基金项目(31260229)；新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程项目(2014721046)

通讯作者: 龚忠诚，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

作者简介: 胡鑫，男，1988年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士。并列第一作者：龚忠诚，博士，副主任医师。

引用本文:

胡鑫,尹小朋,龚忠诚等. 滑膜间充质干细胞与软骨细胞移植修复膝关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1408-1413.

Hu Xin,Yin Xiao-peng,Gong Zhong-cheng et al. Repairing articular cartilage defect of the knee joint by synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1408-1413.

2.1 实验动物数量分析 全部大鼠均进入结果分析。

2.2 一般情况观察 大鼠膝关节软骨缺损植入后手术切口均为Ⅰ期愈合，植入后大鼠膝关节活动佳，手术对大鼠步态未见明显影响，未出现术区感染迹象，术区缝线均故位良好，植入后3周可见手术区域缝线呈自然性脱落，部分缝线残存于术区。植入后大鼠觅食未见明显异常。见图2。

2.3 软骨缺损修复情况 植入后4周，软骨缺损修复处可见局部粗糙状，修复区域可见微黄，可见明显边界；4组缺损修复处与周围软骨组织平齐，可见壳聚糖支架材料与周围组织局部融合。修复8周，缺损处修复缺损组织表面不光滑且不平整，仍可见凹陷缺损区域，整合一般；4组缺损修复处与周围软骨组织可见平齐，壳聚糖支架材料与周围组织融合尚好，未见周围软组织局部明显坏死感染迹象发生。植入后12周，4组缺损处修复组织面较4，8周时改善明显增大，边界模糊不清；4组缺损修复处与周围软骨组织相似未见明显边界，边界不清晰，可见局部残留支架成分，软骨缺损处表面光滑，见图2。

2.4 细胞支架复合物植入后组织形态

苏木精-伊红染色：植入后4周，4组细胞支架复合物中可见少许细胞，支架材料最外层多分布细胞及细胞外基质，支架材料中心未见明显细胞分布，植入后8周，可见支架材料细胞及细胞外基质分布较植入后4周时明显，植入后12周可见细胞及细胞外基质比较4，8周时广泛分布。植入后4周，各组未见软骨样细胞表型，植入后8周可见软骨细胞样表型出现于细胞支架复合物周围，深红色为支架材料，植入后12周，可见各组软骨细胞表型较4，8周明显，见图3。

甲苯胺蓝染色：植入后4周，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组可见细胞核染色为深蓝色，细胞质和细胞外基质均为蓝色，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组可见散在类软骨样组织。植入后8周，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组类软骨样组织增多比较植入后4周明显增多，细胞质和细胞外基质均呈蓝染阳性，单纯滑膜间充质干细胞组未见明显改变，植入后12周，滑膜间充质干细胞：软骨细胞1︰2组中软骨组织增多较植入后4，8周明显，细胞及细胞外基质呈蓝染强阳性，见图4。

番红O染色：植入后4周，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞：软骨细胞1︰2组可见少许软骨基质，软骨细胞核为蓝染，分布于支架材料外层。植入后8周，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞：软骨细胞1︰2组可见细胞及软骨基质向材料中心分布趋势。植入后12周，可见细胞及软骨细胞基质较植入后4，8周表达明显增强，深蓝色为支架材料，见图5。

免疫组织化学染色：植入后4周，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组可见新生软骨基质部分出现不同程度的Ⅱ型胶原阳性反应，部分细胞及细胞外基质可见少许棕黄色颗粒分布，基底部着色较深。植入后8周，可见滑膜间充质干细胞组：软骨细胞1︰2组中，新生软骨基质染色显示为阳性表达，部分棕黄色颗粒比较4周深染色。植入后12周，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色染色呈强阳性表达，软骨细胞中的基质染色呈现棕褐色且基底部着色比较深，见图6。

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