发表：《中国神经再生研究（英文版）》杂志2009年第11期第846-852页

    作者：赵仁亮^1，2，王拥军¹

    赵仁亮，男，汉族1965年生，山东省潍坊市人，在读博士，主任医师，教授。主要从事脑血管疾病和神经变性病方面的研究。

    单位：1首都医科大学附属北京天坛医院，北京市 100050

    2青岛大学医学院附属医院神经内科，山东省青岛市 266003

    摘要

    背景：短暂性脑缺血预处理可诱导脑缺血耐受已得到诸多研究证实，但脑缺血预处理后机体如何启动内源性脑保护作用的机制目前尚无定论。

    目的：创新性提出以两次线栓法建立局灶性缺血再灌注模型，动态性检测预处理后缺血再灌注不同时间窗促红细胞生成素及HIF-lαmRNA及蛋白的表达，探讨促红细胞生成素与HIF-lα在脑缺血耐受中的作用。

    设计、时间和地点：随机对照的动物实验，于2006-03/2007-03在青岛大学医学院解剖学研究室完成。

    材料：兔抗鼠HIF-lα单克隆抗体和生物素化羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗鼠EPO单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。一步法RT-PCR 试剂盒购自德国QIAGEN公司。

    方法：将健康雄性Wistar大鼠99只随机分3组：假手术组9只、未缺血预处理组45只和缺血预处理组45只。缺血预处理组采用二次线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉制备预缺血-再灌注-缺血-再灌注模型。未缺血预处理组用假手术代替预缺血。缺血预处理组和未缺血预处理组再根据第1次再灌注时间分为再灌注1，3，7，14，21d 5个亚组，9只/亚组。假手术组两次均为假手术。

    主要观察指标：大鼠缺血侧大脑皮质区、纹状体及海马区HIF-lα与EPO蛋白的表达及缺血侧额顶叶皮质上部HIF-lα与EPOmRNA的表达。

    结果：①组间比较：与未缺血预处理组相比，缺血预处理组再灌注1，3，7d缺血侧大脑皮质、纹状体和海马 HIF-lα蛋白表达明显增高﹙P<0.05或P<0.01﹚；缺血预处理组再灌注3和7d缺血侧大脑皮质、纹状体和海马 EPO蛋白表达，缺血侧额顶叶皮质上部HIF-1αmRNA和EPOmRNA表达明显升高（P< 0.05）。②时序表达：缺血预处理组再灌注3d缺血侧大脑皮质、纹状体和海马 HIF-lα蛋白和缺血侧额顶叶皮质上部HIF-lαmRNA表达开始升高，持续到7d后逐渐下降。EPO蛋白和mRNA表达在时序表达上与HIF-lα蛋白一致。（3）相关性：EPO mRNA表达与HIF-1αmRNA表达呈显著正相关(r=0.737，P<0.01)。

    结论：缺血预处理诱导了脑缺血耐受，预缺血诱导的内源性HIF-1α及其靶基因EPO表达增加参与脑缺血耐受的形成。

    关键词：缺血耐受；缺血预处理；脑缺血；大鼠；缺氧诱导因子1α；促红细胞生成素

    来自课题的更多信息：

    国内外该小范围领域同类研究水平介绍和本文创新点：

    以往有关脑缺血预处理模型多采用沙土鼠，因其先天缺乏后交通动脉，解剖特点与人类差别较大，相比之下，Wistar大鼠和SD大鼠有完整的Willis环，与人类脑血管构成相似，缺血后梗死体积较恒定，更适合制备缺血耐受模型。在缺血预处理模型的选择上，以往多采用全脑-全脑、局灶-全脑或全脑-局灶模式，操作相对简单，但与人类缺血性脑卒中不尽相同；有些虽采用局灶-局灶模式（与人类脑缺血最为接近），但大多需要开颅，难度大、实验条件要求高、不易实施。本研究采用两次线栓法制备大鼠预缺血-再灌注-缺血-再灌注模型，能尽量减少对脑的手术性损伤，而且所选血管可被重复性堵塞及再通。

    尽管缺血预处理能诱导脑缺血耐受已被诸多研究证实，但脑缺血预处理后机体如何启动内源性脑保护作用的机制目前尚无定论。本实验参照Longa线栓法，先后两次线栓堵塞MCA建立大鼠MCA预缺血-再灌注-缺血-再灌注模型，测定脑梗死体积，动态检测预处理后不同缺血再灌注时间窗HIF-lα以及EPO的表达，分析二者在脑缺血耐受中表达的变化规律，。本研究同时探讨了HIF-lα及EPO蛋白及mRNA 与脑缺血耐受的关系，这在国内外相关研究中系首次报道。

    为了与当前国内外同类研究综合比较，我们进行了国内外查新（本课题鉴定查新报告编号为200705321358），课题鉴定时的查新报告摘录如下：

    ⑴查新点：采用两次线栓法建立大鼠局灶性缺血耐受模型，研究大鼠脑缺血耐受中缺氧诱导因子和促红细胞生成素的蛋白和mRNA表达。

    ⑵查询结果：经国家授权单位正式检索，国内除本课题组成员所发表的文献外，未查到与查新点内容类似的研究；国外查到类似的研究报道，但所采用的动物模型不同。

    附同类研究比较

    国内同类研究

    1、 张会军等。中国实用神经疾病杂志，2008，11（4）：49-51

    探讨了脑缺血预处理（IPC）对大鼠永久性局灶性脑缺血后HIF-1α和iNOs的影响。

    相同点：IPC预处理措施相同（MCAO 10min 作为IPC）；

    不同点：①仅检测HIF-1α蛋白表达的变化；②IPC10min，48h后永久性MCAO不同时间HIF-1α蛋白表达的变化。而本研究系分别在缺血预处理后1d、3d、7d、14d、21d进行再次缺血2h再灌注22h，然后取脑检查。应用免疫组化方法检测HIF-lα与EPO蛋白的表达，逆转录聚合酶链式反应技术检测EPOmRNA 和HIF-1αmRNA的表达。探讨了不同时间间隔的影响。

    2、吴海琴等. 卒中与神经疾病，2006，13(1):34-36

    观察HIF-la和EPO在前脑缺血大鼠海马中的动态表达规律。

    相同点：观察指标同为HIF-la和EPO。

    不同点：①采用双侧颈总动脉永久性阻断法(2-VO)建立大鼠前脑缺血的动物模型，未作IPC；

    ②仅应用免疫组化法检测大鼠海马CA 区HIF-1a和EPO的蛋白表达水平。因此，仅反映了永久性缺血后HIF-1a和EPO的蛋白表达水平，未探讨脑缺血耐受的作用。

    3、 彭洪军等. 临床儿科杂志，2007，25（6）：484-487

    观察缺血预处理对新生Wistar大鼠海马CA1区HIF-1αmRNA表达的影响。

    相同点：观察指标为HIF-lamRNA表达。

    不同点：①动物为新生Wistar大鼠；②IPC 8min；③采用原位杂交法检测大鼠海马CA1区HIF-1αmRNA表达的变化

    4、郝玉曼等.脑与神经疾病杂志,2003,11(6):324-36

    观察局灶脑缺血预处理对HIF-1α表达的影响，探讨其在脑缺血耐受中的意义。

    相同点：①IPC预处理措施相同（MCAO 10min 作为IPC）；②观察指标为HIF-la蛋白的表达。

    不同点：①动物为SD大鼠；②仅应用免疫组化法检测大鼠HIF-1a蛋白表达水平。