骨髓间充质干细胞的分离培养

由于骨髓间充质干细胞不易引起免疫排斥，易于外源基因的导入和表达，而同时又具有比其他间充质干细胞来源更加广泛、更加易于分离培养等特点，使其在组织工程学、细胞治疗和基因治疗等方面具有广泛应用价值。

骨髓间充质干细胞的表面抗原并不是独特的，它既有间质细胞的表面抗原特征，又具有内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞的表面抗原，所以目前为止并未找到非常特异性的骨髓间充质干细胞标记分子。但由于其具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等分化的能力，而以其多向分化能力予以反证是目前骨髓间充质干细胞鉴定的金标准之一。

骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，在适当条件下，它不仅可以分化为同源于中胚层的间质组织细胞，还可以突破胚层界限，分化为非中胚层组织。由于骨髓间充质干细胞比其他成体干细胞更易获得，易于外源基因的导入和表达，所以作为组织工程的种子细胞及细胞替代治疗的一种来源被广泛应用于干细胞的研究中。

本期专题介绍的10篇文章，分别从骨髓间充质干细胞培养过程中的基因转染、细胞因子调控等方面作了有益的探索。

1  改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

王美华

解放军军事医学科学院附属医院消化内科，北京市  100071

国家自然科学基金青年基金(30800277)

小鼠间充质干细胞培养7 d，见贴壁细胞呈克隆样生长

推荐理由：目前实验室以小鼠为干细胞研究的动物体内研究模型既经济又便利，可控性操作性强。但小鼠骨髓间充质干细胞培养，扩增，传代，保持干细胞活性困难，实验通过贴壁筛选和Percoll分离法，优化干细胞培养液血清和换液方式，培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞。参照以往人和猕猴骨髓间充质干细胞培养经验，对小鼠骨髓间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清，控制血清为培养液的10%。用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后，滤去骨渣和小肌肉碎块。然后加在相对密度1.082的percoll分离液上，以1.5×10⁶/cm²浓度接种75 cm²培养瓶。此方法可方便，快捷的获得纯度较高的间充质干细胞并保持其活性，为干细胞动物应用实验，扫清障碍。

另外，目前干细胞因其本身增殖传代的特点，干细胞体内示踪实验中常用的各种染剂，病毒转染，磁素标记等方法，荧光保持时间短，而稳定基因转染又会影响干细胞活性，因此不能满足长期体内观察实验需要。而实验中所用的长效DiI染剂，本身用于神经干细胞染色观察，可持续数月，经验证其标记骨髓间充质干细胞后，经多次传代，仍有较高荧光效果，可以很好解决干细胞示踪实验困难，见2009年45期8929页。

2  密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞

刘斌

中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市  510630

广东省科技计划项目(2007B031001004，2005B34001003)

传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞Giemsa染色结果

推荐理由：由于胎儿骨髓间充质干细胞免疫原性明显低于成人，因此利用从胎儿骨髓中分离培养的间充质干细胞建立干细胞库，可能是解决基因工程和组织工程细胞来源的有效手段之一。

实验探讨胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养的条件，观察其生物学特性，建立稳定的骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系。应用成骨诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，结果表明大部分细胞碱性磷酸酶染色呈阳性反应，由于碱性磷酸酶为骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化成熟的指标之一，因此可以证明实验骨髓间充质干细胞可成功诱导为成骨细胞。应用含转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，诱导后细胞表达软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原，表明胎儿骨髓间充质干细胞可诱导为软骨细胞，2009年40期7913页。

3  比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性：推荐第3～6代细胞可用于临床

胡炜

新疆维吾尔自治区中医院脊柱二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市  830000

北京市优秀人才项目(2006ID0900300332)

第2代骨髓间充质干细胞

第9代骨髓间充质干细胞

推荐理由：研究表明，人骨髓间充质干细胞在原代培养的初始浓度约为500个/培养皿，到原代培养末期能扩增到6.1×10⁵个，传代后以每2 d倍增1次的速度扩增，这种几何级数的扩增能持续10代左右，但是各代骨髓间充质干细胞其生物学特性是否相同，目前仍无准确定论。

实验着眼于临床组织工程的实际需求，主要从细胞形态、MTT比色试验及细胞周期这3方面，比较第2～11代骨髓间充质干细胞的生物学特性。MTT比色试验及流式细胞仪分析结果发现：各代细胞MTT值逐渐升高，到第9代时达到最高，从第10代开始下降；与此同时，细胞周期分析结果示虽然细胞增殖到第11代，分裂期细胞数量仍呈上升趋势，但从第6代开始凋亡细胞数量明显增加，第8代以后凋亡细胞数量达60%以上，这与形态学观察中发现的第9代后细胞生长减慢、出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象基本一致，见2009年49期9709页。

4  脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

旷文勇

湖南省儿童医院血液内科，湖南省长沙市  410007

湖南省科技厅重点支持项目(06SK2007)

脐带血清原代骨髓间充质干细胞培养第6天，出现梭形细胞组成的集落

推荐理由：骨髓间充质干细胞可以在特定实验条件下分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、肌管及神经元等多种间充质组织细胞，且具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应，具有易获得、易培养、低免疫原性、易于外源基因的转入和表达等特性，已成为具有细胞治疗和基因治疗临床疾病潜在实用价值的有效载体。

实验通过对比脐带血清和成人自体血清体外培养骨髓间充质干细胞的效果，建立一种基于临床移植需要的体外培养人骨髓间充质干细胞的培养体系，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原和定向诱导分化，完成对获得细胞的初步鉴定，见2009年45期8917页。

5  人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定

张向荣

南昌大学第一附属医院眼科，江西省南昌市  330006

江西省科技厅重大科技招标项目(200604)；江西省卫生厅重大科技招标项目(200502)；江西省自然科学基金资助项目(0540056)

原代培养14 d融合成片的骨髓间充质干细胞排列呈漩涡状

推荐理由：骨髓中间充质干细胞含量极少，要获得足够的间充质干细胞，就必须实现其体外分离培养、扩增。目前常用的分离方法有：密度梯度离心法、贴壁分离筛选、特制培养板筛选法、流式细胞仪分离和免疫磁珠分离法。实验采用密度梯度离心与贴壁筛选结合的方法，利用骨髓内不同成分间的比重差异，保留其中的血细胞成分(剩下的主要为白细胞和有核骨髓细胞)；然后利用白细胞及骨髓中造血干细胞在体外培养条件下主要呈悬浮生长的特性，通过贴壁培养及定期更换培养液，去除不贴壁生长的白细胞和造血干细胞，从而得到较为纯净的、易贴壁生长的间充质干细胞，见2009年19期3618页。

6  不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响

钟达

中南大学湘雅医院骨科，中南大学骨科研究所，湖南省长沙市  410008

湖南省科技厅科技计划资助(06sk3029-2)

推荐理由：富血小板血浆是全血经过浓集、分离而获得的血液制品，含有高浓度促进骨组织和软组织再生修复的多种生长因子，对骨髓基质干细胞有活性调节作用。实验从比格犬提取、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，观察并分析不同浓度富血小板血浆凝胶对骨髓间充质干细胞的体外增殖效应、最佳浓度配比；结果发现，干预早期不同体积分数的富血小板血浆凝胶对体外培养的犬骨髓间充质干细胞细胞增殖均有促进作用，并证实了在体外实验条件下体积分数为6.25%作用效果较佳，见2009年49期9727页。

7  建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

杨丽

暨南大学药学院中药学教研室，广东省广州市  510632

国家自然科学基金资助项目(30472274)；国家中医药管理局中医药科学研究专项(04-05JL19)；广东省自然科学基金重点项目(04105837)；广东省社会发展计划重点引导项目(2004B33001004)

第3代骨髓间充质干细胞形态观察

推荐理由：目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法中以全骨髓贴壁法和密度梯度离心法最为常用。细胞表面分子标记分选法和细胞筛筛选法虽然分离出的细胞纯度高，但由于分离细胞数量少，活性低，加之技术难、成本高，因此较少采用。

目前还没有单一某种特异性的方法用来鉴定骨髓间充质干细胞，实验主要通过观察细胞贴壁时间和增殖速度来比较全骨髓分离法和密度离心法分离培养骨髓间充质干细胞的优缺点，结果表明全骨髓贴壁法能够更快获得骨髓间充质干细胞，且均质性好，见2009年6期1064页。

8  全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

蔡鹏

福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市  350001

福建省自然科学基金资助项目(C0710018)

推荐理由：目前对于骨髓间充质干细胞分离纯化及体外培养还没有统一的方法，全骨髓贴壁分离法分离骨髓间充质干细胞，是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长而造血细胞悬浮生长的特性对两者进行分离，虽然所得细胞成分较复杂，但由于骨髓冲洗液中存在滋养细胞和某些细胞因子，促使骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛，并且经换液传代后细胞仍可达到很高的纯度。

实验通过全骨髓贴壁培养法可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性，经诱导培养后具有多向分化潜能，为后续干细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞，见2009年36期7073页。

9  周期性压力培养对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响

李正章

¹南昌大学医学院，江西省南昌市 330006；²南昌大学第二附属医院心内科，江西省南昌市  330006

江西省科学技术厅课题(320.2410)

10.64 kPa周期性压力干预后骨髓间充质干细胞存活情况

推荐理由：骨髓间充质干细胞即使在骨髓中的数量也极少，并随年龄的增长逐渐减少。各种外界应力对细胞增殖有重要的作用，但对骨髓间充质干细胞最佳的压力及加载时间的力学研究尚少。

实验重点分析不同的周期性压力对骨髓间充质干细胞增殖活性及细胞周期的影响，以探索骨髓间充质干细胞培养的最佳力学参数，达到大量扩增的目的。实验证实5.32～21.28 kPa的周期性(6 h/d，持续3 d)压力可促进骨髓间充质干细胞的增殖，以21.28 kPa压力最为明显，而超过这一压力时(29.26 kPa)则出现细胞死亡增多，增殖活性下降的现象，见2009年19期3628页。

10  成人与胎儿骨髓间充质干细胞生物学性状的比较

孙晓娟

青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东省青岛市266003

第3代成人骨髓间充质干细胞形态

推荐理由：近年来研究发现，胎儿骨髓间充质干细胞保持了更原始的间充质干细胞特征，比成人骨髓间充质干细胞具有更强的增殖潜能和多向分化的能力；且胎儿间充质干细胞分离成份单纯，容易成功，增殖旺盛，在普通培养条件下不向肝细胞分化。

实验分别对成人和胎儿的骨髓间充质干细胞进行分离培养，结果证明，成人和胎儿骨髓间充质干细胞在形态学、生长特性、免疫表型上基本相似，两者均可作为骨髓间充质干细胞的来源，见2009年14期2701页。