人胚胎干细胞源酪氨酸羟化酶阳性细胞具有多巴胺能神经元功能吗？电生理学资料验证
宋天然^1,2，王月^3,4，陈贵安^1,2，邢国刚^3,4
1北京大学第三医院生殖中心和干细胞研究中心，北京 100191
2北京大学第三医院妇产科，北京 100191
3北京大学神经科学研究所和神经生物学系，北京 100191
4教育部和公共卫生部神经科学重点实验室，北京 100191
宋天然，女，1980年生，博士，主要从事干细胞研究
通讯作者：陈贵安，M.D.，教授，E-mail: chenguian2008@bjmu.edu.cn
邢国刚，M.D., Ph.D.,副教授，E-mail: ggxing@bjmu.edu.cn.
摘要
背景：研究者对人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元的诱导策略、细胞化学特性等研究做了一些工作，但在电生理方面的探讨还很少。
目的：观察改良的“无血清四步法经拟胚体培养体系”方法诱导人胚胎干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞的效率，并从电生理角度判断其功能特性。
设计、时间和地点：神经电生理的观察实验，于2004-09/2008-08在北京大学第三医院生殖中心和干细胞研究中心以及北京大学神经科学研究所和神经生物学系完成。
材料：人类胚胎干细胞系PKU-1.1由北京大学第三医院生殖中心建立，膜片钳记录系统由北京大学神经科学研究所提供。
方法：采用改良后的“无血清四步法经拟胚体培养体系”，应用音猬因子和成纤维细胞生长因子8体外诱导人胚胎干细胞源性酪氨酸羟化酶阳性细胞，在对其细胞核型及特异性标志物进行检测的基础上，选取分化后的密封电阻大于1G的酪氨酸羟化酶阳性细胞形成全细胞记录模式：钳制电压-70 mV，去极化至-80 mV，阶跃10 mV，至+40 mV，共13次，时程10 ms，记录电流变化。
主要观察指标：体外诱导的人胚胎干细胞源性酪氨酸羟化酶阳性细胞的核型、特异性标志物及其细胞膜上电压门控性离子通道的电生理特性。
结果：诱导分化得到的细胞形态一致，大多数细胞（>90%）表达多巴胺能神经元的标志物β-tubulion和酪氨酸羟化酶，并仍表达神经前体细胞的标志nestin；分化前后细胞核型保持正常，均为(46, XX)；膜片钳检测显示，所记录的10个酪氨酸羟化酶阳性细胞均在-30mV左右时开始出现一种内向电流，该电流在-10或0 mV时达到峰值；在-10mV左右开始出现一种延迟的外向电流。平均内向电流密度峰值为（-50.05±15.50）pA/pF，平均外向电流密度峰值为（41.98±13.55）pA/pF。
结论：经“无血清四步法经拟胚体培养体系”培养的人胚胎干细胞经体外定向诱导后，分化的酪氨酸羟化酶阳性细胞90%以上具有一定的多巴胺能神经元特性，特别是具有神经元性电生理特性，即电压门控性钠、钾离子通道。
关键词：人胚胎干细胞；诱导分化；多巴胺能神经元；膜片钳记录；帕金森病

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